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A-MATERIEL BIOLOGIQUE, MILIEU ET CONDITIONS DE CULTURE

A-1-MATERIEL BIOLOGIQUE
A-2-MILIEU ET CONDITIONS DE CULTURE
A-2-1-Milieu de culture
A-2-2-Conditions de culture
A-2-3-Réalisation des passages
A-2-4-Cinétique de prolifération
A-2-5-Problème de contamination

A-1-MATERIEL BIOLOGIQUE

Afin d'obtenir des prélèvements de tissus de trachée humaine saine, nous avons travaillé en collaboration avec des services hospitaliers. Ces derniers nous ont fourni des fragments de trachée prélevés lors d'intervention chirurgicale post-mortem pour don d'organe (Service de Chirurgie Thoracique, Pr. L. Couraud), après en avoir contrôlé la caractère non pathogène. Les prélèvements ont été immergés immédiatement dans un milieu de conservation, milieu F-12 Coon's Modification (Sigma) conservé à 4°C à l'hôpital, dans des pots stériles. Les mises en culture ont été réalisées moins de 24 heures plus tard.

Les problème inhérents à notre travail ont été l'approvisionnement en prélèvements.

A-2-MILIEU ET CONDITIONS DE CULTURE

Toutes les manipulations au laboratoire ont été effectuées sous hotte stérile à flux laminaire verticale ou horizontale (ADS-laminaire)

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A-2-1-Milieu de culture

Le milieu de culture a été choisi d'après les données de la littérature (Bordenave, 1993) : Milieu Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DME) / Ham's Nutrient Mixture F-12 (Sigma).

Ce milieu est supplémenté en :

- Ultroser G 2 % (IBF) : Il s'agit d'un substitut de sérum de veau foetal (SVF) utilisable pour la culture de nombreuses lignée cellulaires ; l'activité biologique de 10 ml de solution d'Ultroser G reconstituée équivaut à celle de 50 ml de sérum de veau foetal. Son intérêt est lié à une composition et une activité biologique constantes, d'un lot à l'autre, contrairement à celles de sérum de veau foetal qui présentent les inconvénients suivants.

* une variablité de qualité en fonction des lots (nécessité de tester les lots de SVF),

* une contamination virale possible des lots de SVF quelle que soit la rigueur des contrôles de qualité.

- L-Glutamine (2,5 mM) : Elle est renouvelée toutes les 3 semaines en raison d'une demi-vie très courte.

- Antibiotiques et antifungiques (Sigma) : Pénicilline (200 U/ml), streptomicine (200 µg/ml), amphotéricine B (2,5 µg/ml).

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A-2-2- Conditions de culture

a - préparation des boîtes de culture

Le fond des boîtes de Pétri est enduit de collagène de type IV (collagène 0,1 % p/v, acide acétique 0,2 % v/v (Sigma type VI de placenta humain)). La solution de collagène est placée dans une boîte de Pétri pour une nuit à température ambiante ; le lendemain l'excédent est enlevé à l'aide d'une pipette Pasteur. Nous soumettons ensuite les boîtes à des vapeurs d'ammoniaque (solution à 10 %) pour une nuit, à température ambiante, afin de réticuler le collagène. Les boîtes sont enfin rincées avec du tampon PBS (Phosphate-buffered saline : phosphate disodique 6,46 mM, phosphate monopotassique 1,47 mM, chlorure de sodium 1,37 mM, chlorure de potassium 2,68 mM) filtré puis stockées à + 4°C jusqu'à utilisation.

b- Mise en culture

Dès réception d'un fragment de trachée, nous prélevions l'épithélium en "pelant" l'intérieur de la trachée. L'épithélium est ensuite découpé en fragments de 1 à 2 mm² puis déposé dans une boîte de Pétri collagébée de 10 cm² et cultivé avec 1 ml du milieu de culture supplémenté. Il est possible de mettre en culture plusieurs explants dans la même boîte. Nous avons ainsi une colonisation plus rapide de la boîte de culture. Les boîtes sont placées dans un incubateur, à 37°C, en atmosphère humide (humidité relative de 98 %) contenant 5,0 % +- 0,1 % de C0₂. Le milieu de culture est renouvelé 3 fois par semaine.

Au bout de 4 à 5 jours, nous pouvons observer une colonisation de la boîte de Pétri par les cellules (appelée sortie d'explant). Il faudra attendre 15 à 20 jours pour avoir une colonisation de la surface de la boîte de plus de 70 %. Il est alors possible de "repiquer" les explants, c'est-à-dire prélever les explants et les disposer dans une nouvelle boîte. 2 à 3 jours plus tard, les explants redonnent des cellules.

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A-2-3-Réalisation des passages

Les cellules épithéliales de la trachée ont un nombre limité de générations in vitro et n'établissent pas de lignées continues. Lorsque les cellules forment une monocouche dans le boîte, il faut les remettre en suspension par trypsination (voir ci-dessous) et les répartir en boîte filles d'un premier passage. Lors de notre expérimentation, nous nous sommes limités à un seul passage afin que les cellules ne perdent pas leurs propriétés caractéristiques morphologiques, immunologiques et physiologiques. Les passages sont réalisés en éliminant les surnageants et en recouvrant les cellules d'une solution de PBS contenant : trypsine 0.13 % / EDTA 5mM, 2 min à 37°C. A ce stade, si nous les observons au microscope, les cellules acquièrent une forme ronde, ce qui indique qu'elles se détachent de leur support. Le même volume de milieu supplémenté est alors ajouté ce qui permet une inactivation immédiate de la protéase (par l'Ultroser G). Les cellules sont alors "douchées" avec du milieu de culture et l'ensemble est introduit dans un tube à centrifuger, stérile (50 ml, Falcon). La centrifugation s'effectue pendant 15 min à 800 g. Le culot est remis en suspension dans un volume connu de milieu de culture supplémenté. Les cellules sont ensuite dénombrées avec une cellule de Malassez et ensemencées à une densité déterminée (40 000 cellules/cm²) dans des boîtes de culture (Nunc) quatres puits (2 cm²/puits) ou 96 puits (0,32 cm²/puits) ou lames Lab-Tek (Nunc) pour tous les tests qui vont suivre. Les cellules seont toujours maintenues dans l'incubateur et entretenues avec le milieu de culture complet cité précédemment.

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A-2-4-Cinétique de prolifération

Afin d'étudier la croissance de ces cellules d'une part, et l'importance et/ou la nécessité du support de collagène pour ce type de cellules d'autre part, nous avons fait une étude de cinétique de la prolifération de cellules cultivées dans des boîtes de microfiltration de 96 puits enduites ou non de collagène de type IV.

Le milieu de culture est renouvelé 3 fois par semaine et de façon concomittante au dénombrement de cellules, réalisé après trypsination. Nous portons alors le nombre de cellules par unité de surface (cm2) en fonction du temps, soit à J1, J4, J6, J8, J11, J13 après l'ensemencement.

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A-2-5-Problème de contamination

a - Contamination par d'autres cellules

Il nous est arrivé d'observer, dans la culture cellulaire, des cellules d'allure fibroblastique. Il est aisé de les différencier d'après des critères morphologiques et immunocytochimiques (marquage avec un anticorps anti-vimentine : kit DAKO EPOS anti-vimentine / HRP et contrôle négatif correspondant).

b - Contamination par les micro-organismes

Un des plus gros problèmes de la culture cellulaire est la contamination par des micro-organismes et ce, d'autant plus que la paroi trachéale n'est pas stérile. Ces micro-organismes peuvent produire des métabolites, consommer des éléments nutritifs, altérer le métabolisme ou la morphologie des cellules cultivées.

c- Prévention de la contamination

La prévention de la contamination peut être résumée en quelques étapes primordiales :

- jamais de pipetage par la bouche,

- désinfecter la paillasse de la hotte à flux laminaire et les mains à l'alcool 70 % et à l'eau de javel,

- autoclaver le matériel 3 fois de suite : verrerie, pinces, ciseaux,

- utiliser des boîtes stériles garanties,

- utilisation d'antibiotiques, et dans notre modèle expérimental à des concentrations 2 fois supérieures à celles couramment rapportées dans la littérature (Romet-Haddad, 1992 ; Chevillard, 1992),

- filtrer les milieux...

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Rapports de stages
  DEA
   Introduction
   I
   II.A
   II.B
   II.C
   II.D
   II.E
   III.A
   III.B
   III.C
   III.D
   Discussion
   Bibliographie