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EPITHELUIM TRACHEAL HUMAIN EN CULTURE
Caractérisation et application pour étudier
l'effet d'un mélange gazeux contenant
un narcotique halogéné

INTRODUCTION

Il est communément admis que les études de biocompatibilité chez l'animal, coûteuses, longues, d'interprétation délicate où il est difficile d'obtenir une approche statistique fine des résultats, ne doivent être réalisées qu'en dernière intention, après des études in vitro utilisant des cellules, des tissus ou des organes en culture ou non. Ainsi, le développement de tests in vitro offre des moyens qui permettent de faire la part entre biomatériaux potentiellement utillisables et biomatériaux non adaptés à des applications chez l'Homme (Kirkpatrick, 1990). Le principe de toute culture in vitro est de maintenir vivants, en dehors de l'organisme, un organe, un tissu ou des cellules non organisées en tissu mais capables de se diviser et d'exprimer in vitro métabolisme et fonctions spécifiques (Sigot, 1992).

L'absence de toxicité d'une substance destinée au contact avec des tissus vivants doit être démontrée et la cellule peut être considérée comme la plus petite unité fonctionnelle susceptible de percevoir le potentiel toxique éventuel attaché à cette substance. C'est pourquoi notre travail a consisté en l'obtention d'un modèle de culture de cellules épithéliales trachéobronchiques d'origine humaine, avec comme objectif l'utilisation de ce modèle pour étudier l'influence de gaz anesthésique.

Un tel modèle de culture avait déjà été mis au point au laboratoire, mais il nous a été demandé (préalablement à l'étude des gaz) d'affiner la caractérisation phénotypique de ces cellules. En effet, s'agissant de la différenciation de ces cellules en culture, la revue de la littérature fait appel à plusieurs possibilités d'expression phénotypiques, d'après les conditions de culture (Jacquot, 1990 ; Benali, 1991) et en particulier de la présence ou non d'acide rétinoïque (Mc Dowel, 1987 ; Jetten, 1987, 1989a,b,c, 1992 ; Chopra, 1989 ; Lotan, 1992 ; Saunders, 1993). En effet, il est connu que l'acide rétinoïque joue un rôle central dans la différenciation des progéniteurs trachéobronchiques in vitro (figure n°1).

Fig 1 : Cliquez pour l'agrandir

En absence d'acide rétinoïque, il y a induction d'une différenciation appelée différenciation squameuse. Cette différenciation se traduit entre autres par une augmentation des tonofilaments (Jetten, 1989a), une perte de l'inhibition de contact (Chopra, 1989), une augmentation du sulfate de cholestérol (Rearick, 1987), une augmentation de l'activité transglutaminase de type I (Jetten, 1987, Saunders, 1993), enzyme qui catalyse la formation d'une enveloppe réticulée : il s'agit d'une couche organisée de protéines déposée sous la membrane plasmique (épaisseur approximative 120 Ä, dense aux électrons) et particulièrement caractéristique du phénotype squameux. Ce processus de formation d'enveloppe est appelé "cornification" par les anglo-saxons. La différencition squameuse est physiologique dans certains tissus tels que l'épithélium de la peau et de l'oesophage. Par contre, la différenciation squameuse de l'épithélium respiratoire n'est observée in vivo que dans des conditions pathologiques (Keenan, 1983 ; Gouveia, 1982).

Par contre, la présence in vitro d'acide rétinoïque, induit la différenciation en cellule mucociliaires (Jetten, 1992). Il a aussi été décrit in vitro que la présence d'acide rétinoïque induisait des modifications concernant les polarité et prolifération cellulaires, ainsi que la sécrétion de granules (Chopra, 1989). Des transitions de cellules épithéliales en cellules fibroblastiques ont également été observées in vitro (Benali, 1991).

Nous avonc donc tenu compte de ces problèmes dans notre travail. C'est pourquoi la caractérisation des cellules épithéliales, avec pour but la mise au point d'un modèle d'évaluation de l'influence de gaz anesthésique, a été complétée par l'étude de la modulation de l'activité cellulaire en fonction de certaines conditions de culture (présence ou non d'acide rétinoïque).

Les agents anesthésiques usuels par inhalation sont utilisés comme étant des produits anesthésiques narcotiques provoquant la perte de conscience des patients. En pratique, l'effet anesthésique est une fonction directe de la concentration alvéolaire d'anesthésique. La concentration alvéolaire minimale (CAM) est définie comme celle qui supprime les réactions à un stimulus douloureux chez 50% des patients (Lienhart, 1987). Ce paramètre est variable d'un produit anesthésique à l'autre. L'effet anesthésique recherché est obtenu et adapté au cours de l'acte anesthésique en faisant varier la concentration des produits halogénés. En pratique, une concentration alvéolaire 1,5 à 2 fois plus grande que la CAM (0,75% pour l'halothane, gaz que nous avons étudier) est nécessaire pour obtenir un effet satisfaisant. Une concentration élevée peut s'accompagner d'effets indésirables sur l'appareil cardio-circulatoire mais également sur l'appareil d'échange gazeux en particulier la structure trachéo-broncho-alvéolaire.

La démarche de l'anesthésiste est donc d'adapter au sujet l'anesthésique d'une part, et la façon de délivrer l'anesthésique choisi d'autre part, pour atteindre le but fixé, en règle une narcose autorisant le geste chirurgical, sans mettre la vie du sujet en danger.

Lors d'une anesthésie, les patients présentent souvent des complications respiratoires per et postopératoires dont les mécanismes physiopathologiques sont complexes. Un des buts de la recherche en anesthésie générale est de mieux connaître les effets cellulaires des anesthésiques.

Un des sites d'action des anesthésiques est représenté par l'épithélium trachéo-bronchique et l'existence d'altérations épithéliales pourraient expliquer les complications respiratoires observées. A ce jour, peu d'études in vitro ont été rapportées dans la littérature concernant l'effet comparé des anesthésiques halogénés volatils utilisés en clinique : elles ont été essentiellement réalisées sur des érythrocytes humains isolés (Kosk-Kosicka, 1993), ou des cultures d'hépatocytes de rat (Wodey, 1993) ou sur des préparations tissulaires animales isolées (Buljubasic, 1992 ; Blancj, 1992 ; Pizov, 1992), mais en aucun cas sur des cultures de cellules épithéliales trachéales.

Notre travail comprendra donc deux parties : la caractérisation et l'amélioration du modèle, suivies d'une étude très préliminaire concernant l'effet de l'air véhiculant un anesthésique halogéné sur l'activité métabolique des cellules de ce modèle.

Rapports de stages
  DEA
   Introduction
   I
   II.A
   II.B
   II.C
   II.D
   II.E
   III.A
   III.B
   III.C
   III.D
   Discussion
   Bibliographie