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B-TECHNIQUES DE CARACTERISATION DES CELLULES EPITHELIALESB-1-MICROSCOPIE Ont été choisis comme critères de caractérisation : - des critères microscopiques (optique et électronique à balayage et à transmission), - des critères immunologiques de l'expression des kératines. Révélation des kératines intracellulaires dans les cellules épithéliales en culture (immunocytochimie) comparativement à des coupes histologiques de la paroi trachéale (immunohistochimie). Révalation des kératines après extraction, séparation et immunodétection après transfert sur nitrocellulose. Les cellules sont observées et photographiées sur le support plastique, à l'aide d'un microscope en lumière directe. B-1-2- Electronique à balayage Les échantillons sont fixés avec 2 % (v/v) de glutaraldéhyde dans du tampon de cacodylate de sodium 0,15 M, pH 7,3 pendant 15 min à température ambiante. Les surfaces sont lavées par du tampon de cacodylate de sodium 0,15 M pendant 10 min. Les échantillons sont alors déhydratés par des séries de traitement à l'éthanol de 25 à 100 %. La déshydratation se fait selon la technique dite du point critique. Les échantillons sont ensuite métallisés par une couche d'or de 20 nm. L'observation est réalisée avec un microscope électronique Hitachi S 2500. B-1-3-Electronique à transmission Les échantillons sont fixés dans du tampon glutaraldéhyde-cacodylate pendant 1 h à 4°C. Les cellules sont lavées dans 0,15 M de cacodylate, puis mis en présence de 2 % (v/v) de OsO4- 0,3 M cacodylate pendant 60 min. Les échantillons sont déshydratés par des séries de traitement à l'éthanol de 25 % à 100 %. La déshydratation est poursuivie par un traitement de propylène-oxide Epon (1:1). Les échantillons sont enfin placés dans de l'Epon pur et polymérisés à 60°C pendant 48 heures. Les coupes (60 µm) sont effectuées avec un diamant et observées avec un microscope électronique à transmision Hitachi HU 11E. B-2-ETUDE DE L'EXPRESSION DES KERATINES Les filaments intermédiaires, notamment les kératines et la vimentine sont des protéines importantes, composants essentiels du cytosquelette qui sont fabriqués par les cellules avec une spécificité variable mais souvent étroite. Les kératines, que l'on appelle aussi cytokératines, appartiennent à une famille codée par plusieurs gènes et correspondent à des polypeptides fibreux intracellulaires, insolubles dans l'eau, présents dans pratiquement toutes les cellules épithéliales. Les kératines peuvent être séparées en deux groupes en fonction de leur poids moléculaire, de leur immunoréactivité avec des anticorps monoclonaux de spécificité restrictive et en fonction de leurs points isoélectriques. Le groupe A (A pour acide, aussi appelé groupe I) est formé par des kératines de poids moléculaires 56,5 ; 55 ; 51 ; 50 ; 50' ; 48 ; 46 ; 45 et 40 kilodaltons (kD) correspondant aux numéros 10, 12-19 de la classification de Moll (1992). Les éléments de ce groupe ont des points isolélectriques plutôt acides. Le groupe B (B pour basique, qu'on appelle également groupe II) est composé des kératines 65-67, 64, 59, 58, 56, 54 et 52 kd, correspondant aux types 1 à 8 de la classification de Moll, qui ont un point isoélectrique plutôt basique (Battifora, 1991). B-2-2-Choix des anticorps monoclonaux anti-kératines
Afin de comparer nos résultats avec ceux déjà obtenus au laboratoire, nous avons de plus utilisé un "cocktail" AE1/AE3 d'anticorps monoclonaux anti-kératines. L'anticorps monoclonal AE1 reconnaît les kératines acides 56,5 ; 50 ; 50' ; 48 et 40 kd et l'anticorps monoclonal AE3 reconnaît les kératines basiques 65-67 ; 64 ; 59 ; 58 ; 56 et 52 kd. Toutes les études d'immunocytochimie ont été réalisées avec des anticorps monoclonaux anti-kératines commercialisés par Boehringer Mannheim. Nous nommerons dorénavant les kératines de la façon suivante : K19 pour la kératine 19, etc... Les concentrations d'anticorps utilisées sont en immunohistochimie : anti-K19 : 20 µg/ml ou anti-K18 : 20 µg/ml ou anti-K13 : 20 µg/ml ou anti-K8 : 20 µg/ml, selon les recommandations du fournisseur. En cytochimie, les concentrations d'anticorps nous semblant les plus favorables ont été : anti-K19 : 80 ng/ml ou anti-K18 : 800 ng/ml ou anti-K13 : 400 ng/ml ou anti-K8 : 80 ng/ml ou AE1/AE3 : 40 ng/ml. B-2-3-Histologie et Immunohistochimie a-Préparation tissulaire Le tissu est fixé dans du formol (3,7 %) puis inclus dans de la paraffine par déshydratation dans les bains suivants : eau (5 min), éthanol 80 % (5 min), éthanol 95 % (2 x 5 min), éthanol absolu (2 x 5 min), éthanol/toluène 1:1 (5 min), toluène (5 min), 2 bains de paraffine à 56°C. Après solidification de la paraffine, le tissu est fragmenté en coupes d'épaisseur de 3 µm puis déposées sur une lame. Avant les études, la coupe est déparaffinée par réhydratation dans les bains suivants : toluène (2 x 5 min), éthanol absolu (2 x 5 min), éthanol 95 % (2 x 5 min), éthanol 80 % (2 x 5 min), eau. b-Coloration Hématéine, Erythrosine, Safran (HES) Principe : il s'agit d'une coloration topographique, de routine, associant une coloration nucléaire et une coloration cytoplasmique. Les noyaux apparaissent violets, le cytoplasme rouge, le collagène jaune. Méthode : après avoir été réhydratée, la coupe est colorée par passages successifs dans les bains suivants : Hématéine (10 min), rinçage à l'eau, bref passage dans l'HCl 1 %, rinçage à l'eau du robinet pour "bleuir" la coupe, Erythrosine 1 % (2 min), rinçage à l'eau, passage dans 2 bains d'éthanol absolu, Safran 5 min. La coupe est ensuite déshydratée et du baume (Histolaque LMR) est ajouté pour maintenir une lamelle sur la coupe. c-Immunohistochimie Un premier anticorps de souris anti-kératines se fixe spécifiquement sur les kératines. La présence de cet anticorps est révélé par la fixation d'un anticorps secondaire biotynilé de lapin anti-souris (kit DAKO LSAB kit, Peroxidase universale K680). Cette méthode utilise la haute affinité de la streptavidine pour la biotine. La streptavidine est couplée à l'enzyme péroxydase et va se fixer sur l'anticorps secondaire biotynilé. L'activité de la péroxydase induira la coloration du chromogène (figure n°2).
L'étude est réalisée sur cellules de premier passage. Les cellules sont ensemencées sur une lame Lab-Tek (8 puits) collagénée à raison de 40000 cellules/cm2. Les cellules sont placées dans un incubateur à C02 pouvant maintenir une atmosphère à 5 ± 0,1 % de CO2 et une humidité relative de 98 % à 37 °C pendant 5 jours. La détection des kératines est faite par un premier anticorps de souris anti-kératines. Ce premier anticorps sera révélé grâce au kit DAKO APAAP Kit, Systeme 40 K670. Cette méthode utilise un complexe immun de deux molécules de phosphatase alcaline fixées sur un anticorps de souris. Cet anticorps est reconnu par l'anticorps secondaire de lapin anti-souris, lui même fixé sur l'anticorps primaire. La coloration du chromogène se fait grâce à l'activité de la phosphatase alcaline (figure n°3).
B-3-1-Extraction des kératines Ont été concernées par ces extrations, des cellules témoins (culture en condition standard), des cellules traitées par l'acide rétinoïque (concentration finale 10-6 M, voir plus loin) afin d'appréhender son influence sur l'expression des kératines 19, 18, 13 et 8. La technique d'extraction utilisée a été décrite par Franke (1978). Son principe repose sur la propriété des kératines à résister à la solubilisation par des détergents non ioniques et par des tampons de faible et de forte forces ioniques. Leur solubilisation est seulement obtenue sous l'action de forte concentration d'urée ou de solution de pH fortement alcalin. Dans un premier temps, la culture cellulaire est incubée en présence d'un détergent non ionique et non dénaturant, le Triton X-100 et dans un tampon de faible force ionique. Ce premier traitement a pour effet de solubiliser la plupart des protéines. Afin d'enrichir la préparation en kératines, celle-ci est broyée dans un deuxième tampon de forte force ionique en présence de Triton X-100. Le culot de kératine obtenu après lavage, est repris dans du tampon PBS. Le dosage des protéines est fait par la méthode de Lowry (1951). B-3-3-Séparation des kératines
Le gel est immergé pendant une heure dans une solution de coloration (méthanol 50 % (v/v), acide acétique 10 % (v/v), bleu de Coomassie R250 (Sigma) 0,20 % (p/v)), puis placé dans une solution décolorante (méthanol 40 % (v/v), acide acétique 7,5 % (v/v)) pendant 30 min. B-3-5-Immunodétection des kératines après transfert sur nitrocellulose Les kératines séparées par électrophorèse sont transférées par diffusion passive sur une membrane de nitrocellulose. Après transfert, les membranes sont saturées avec 3 % de BSA dans du PBS 0,1 M, pH 7,4, pendant 3 h à 37°C. Après lavage dans du PBS 0,1 M, pH 7,4, contenant de la BSA 0,5 % (p/v) et du Tween 20 0,2 % (p/v), les membranes sont incubées en présence des anticorps monoclonaux anti-kératines (19, 18, 13, 8) dilués dans les mêmes proportions qu'en immunocytochimie, dans du PBS-Tween-BSA pendant 16 h à 37°C. Les membranes sont ensuites lavées dans du PBS-Tween-BSA, et les anticorps primaires sont révélés par incubation avec des anticorps secondaires anti-souris marqués à la péroxydase (Institut Pasteur) dilués à 1:1000 dans 0,1 M PBS, pH 7,4 pendant 1 h à 37°C. Les immunoglobulines sont révélées par un chromogène sensible à la péroxydase : chloroaphtol (3 mg/ml de méthanol) dans 0,1 M de PBS, pH 7,4, contenant de l'H2O2 0,02% (v/v). La réaction est arrêtée avec du SDS 0,1 % (v/v). B-3-6-Coloration après transfert La membrane de nitrocellulose est rincée dans du PBS 0,1 M puis incubée 5 min dans une solution de noir amidon (méthanol 50 % v/v, acide acétique 7,5 % v/v, noir amidon 0,1 % p/v). La membrane de nitrocellulose est ensuite décolorée avec une solution de méthanol 50 % v/v et d'acide acétique 7,5 % v/v. |
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