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A - MODELE DE CULTURE CELLULAIRE
A-1-OBTENTION DES CELLULES
A-2-CARACTERISATION MORPHOLOGIQUE DU MODELE
A-3-CINETIQUE DE PROLIFERATION CELLULAIRE
A-4-EXPRESSION DES KERATINES
A-4-1-Histologie et Immunohistochimie
A-4-2-Immunocytochimie
A-4-3-Révélation des kératines après extraction,
séparation et immunodétection après transfert sur nitrocellulose
A-1-OBTENTION
DES CELLULES
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Au cours de ce travail, nous avons
pu bénéficié de 5 fragments de trachée dont les dimensions approximatives
sont de 5 cm de longueur et 2 cm de diamètre, soit pour chaque
prélèvement une surface épithéliale d'environ 31 cm2.
A partir de ces fragments, 59 boîtes de Pétri ont été mises
en culture, contenant chacune 5 explants. Parmi ces 59 boîtes
ensemencées, 5 (soit 8 %) ont donné lieu d'emblée à une culture
contaminée probablement en raison de la non stérilité du prélèvement
obtenu. Toutes les autres ont conduit à une "sortie d'explant",
c'est à dire à l'apparition de cellules sur le support collagéné
comme le montre la photo n°4 : on
y observe des cellules polygonales, jointives en monocouche,
dont le noyau présente plusieurs nucléoles. |
| Dans 30 boîtes (soit 51 % des boîtes
ensemencées), nous avons observé un arrêt rapide de la croissance
cellulaire ainsi qu'un décollement progressif des explants,
échec que nous avons attribué à la qualité du revêtement collagéné.
Pour les 24 boîtes restantes (41 %), nous avons obtenu une "sortie
d'explant" suivie d'une croissance cellulaire : après 2
à 3 semaines de culture environ, l'aspect de la monocouche obtenue
à confluence est visualisé sur la photo n°5. Pour
ces boîtes, les explants ont été "repiqués" plusieurs
fois (jusqu'à 7 fois, soit 4 à 5 mois de culture) pour réinduire
de nouvelles colonisations cellulaires : à partir de ces 24
boîtes, 72 boîtes de Pétri ont été colonisées après "repiquage"
successifs. Le temps moyen au bout duquel des cellules ont été
observées autour des explants est de 6 ± 3 jours. Ces cultures
primaires nous ont permis de réaliser les différentes expériences
exposées plus loin. Dans un petit nombre de boîtes, nous avons
constaté qu'au-dela de 15 jours de culture (pour les premiers
repiquages) ou plus précocément (pour les derniers repiquages)
des cellules d'allure fibroblastique sont apparues. |
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A-2-CARACTERISATION
MORPHOLOGIQUE DU MODELE
Microscopie électronique à balayage (SEM)
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L'aspect observé en microscopie
optique est corroboré par l'aspect obtenu en microscopie électronique
à balayage (photo n°6) :
les cellules observées présentent les caractéristiques morphologiques
attendues d'un épiyhélium respiratoire, à savoir un aspect homogène,
des cellules jointives en monocouche dont certaines présentent
des spécialisations de surface comme les microvillosités (photo
n°7). |
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Microscopie électronique à transmission (TEM)
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L'étude de la couche cellulaire en
microscopie électronique à transmission a montré que les cellules
étaient interconnectées par des desmosomes, structures classiquement
décrites dans les épithéliums (photo
n°8 et photo n°9). |
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Les desmosomes sont aussi appelés macula adherens car ils assurent
une très forte adhésion entre cellules voisines. Les membranes plasmiques
des cellules voisines sont rectilignes et parallèles et sont recouvertes
sur leur face intracellaire d'un matériel dense ou "plaque"
vers laquelle convergent des faisceaux de microfilaments appelés
tonofilaments. Les tonofilaments sont probablement constitués de
kératine ou d'un précurseur de celle-ci.
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A-3-CINETIQUE
DE PROLIFERATION CELLULAIRE
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Vingt-quatre heures après l'ensemencement,
environ 62 % des cellules, sur support collagéné, sont recueillies
contre 25 % des cellules sur support plastique. L'analyse de
la courbe de croissance cellulaire en fonction du temps sur
chaque support fait apparaître deux phases (figure
n°5). Une première phase de latence dure 4 jours
lorsque le support est collagéné et 6 jours lorsqu'il ne l'est
pas. Nous avons obtenu (et ce de façon constante lors des réensemencements)
un rendement d'adhésion cellulaire maximum d'environ 50 %, 24
h après ensemencement, que le support soit collagéné ou non.
Puis la deuxième phase est exponentielle avec des temps de doublement
de la population cellulaire qui sont respectivement d'environ
3 jous et 4,5 jours. Deux semaines après l'ensemencement, la
densité cellulaire sur support collagéné est de 20 x 104
cellules / cm2 soit 3 fois supérieure à celle sur
support plastique. Ces résultats montrent donc l'importance
du support lors de culture cellulaire. |
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A-4-EXPRESSION
DES KERATINES
Nous avons comparé l'expression de quatres kératines représentative
de l'épithélium trachéal respiratoire, les kératines 19, 18, 13
et 8 dans des échantillons issus d'un même prélèvement trachéal,
mais destinés soit à l'anatomo-pathologie, soit à la culture cellulaire
et ce, lors de différents "repiquages".
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A-4-1-Histologie
et Immunohistochimie
Coloration HES (Hématéine Erythrosine Safran)
(photo°
10)
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Sur la partie supérieure de la coupe,
on distingue les cellules épithéliales (cytoplasme rose et noyau
violet) en couche pseudostratifiée, caractéristique d'un épithélium
respiratoire (E). L'épithélium repose sur une membrane basale
(Mb). Au-dessous se situe le tissu conjonctif où l'on peut distinguer
le collagène en jaune. |
Expression des kératines sur coupe tissulaire
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La photo
n°11 (témoin négatif) montre une coupe tissulaire
qui a suivi le même protocole de révélation des kératines que
les photos n°12,
13,
14, 15 mais en absence
d'anticorps monoclonaux anti-kératines. Nous avons détecter
une forte expression des kératines 19 et 8 sur les photos respectives
n°12 et
13
(coloration rouge). Cette expression est uniquement localisée
au niveau de l'épithélium respiratoire. Les photos n°14 et
15
montrent respectivement l'expression des kératines 18 et 13.
Le marquage est faible et semble concerner toute la coupe. L'étude
de l'expression des kératines 19, 18, 13 et 8 a donc révélé
une différence d'intensité de marquage suivant la kératine analysée,
bien que les concentrations d'anticorps utilisées soient identiques. |
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A-4-2-Immunocytochimie
Les photos n°16 et
17
montrent respectivement une forte expression des kératines 19 et
8 sur culture cellulaire de cellules épithéliales. La concentration
des anticorps anti-kératines 19 et 8 est de 80 ng/ml. Comme nous
avons pu l'observer sur les coupes tissulaires, l'expression des
kératines 18 et 13 sur culture cellulaire de cellules épithéliales
est également plus faible (photos n°18
et 19).
La concentration des anticorps anti-kératines 18 et 13 est respectivement
de 800 ng/ml et 400 ng/ml.
Bien qu'il soit impossible de comparer quantitativement l'expression
d'une kératine donnée sur coupe tissulaire par rapport à la culture
cellulaire, nous avons observé les faits suivants : les kératines
19 et 8 sont fortement exprimées à la fois en immunohistochime et
immunocytochimie tandis que les kératines 18 et 13 qui sont faiblement
exprimées en immunohistochimie le sont également en immunocytochimie.
Les marquages des cellules épithéliales trachéales sont donc positifs
pour ces 4 kératines, et négatifs pour d'autres types cellulaires
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- cellules d'allure fibroblastique
observées de temps à autre dans nos cultures (les mêmes anticorps
anti-kératines, aux mêmes dilutions ont été utilisés) (photo n°20) |
| - cellules endothéliales vasculaires
humaines cultivées au laboratoire (photo
n°21). |
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Ces résultats tendent à montrer que les cellules obtenues en culture
sont épithéliales, et que la mise en culture de ces cellules et
leur maintien ne modifient pas leur phénotype quant à l'expression
des 4 kératines étudiées, par rapport au prélèvement dont ces cellules
sont issues.
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A-4-3-Révélation
des kératines après extraction, séparation et immunodétection après
transfert sur nitrocellulose
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Afin d'examiner l'expression des
kératines 19, 18, 13 et 8 par les cellules épithéliales, nous
avons préparé une fraction protéique enrichie en kératines,
que nous avons séparées par électrophorèse en gel dénaturant
de polyacrylamide à 10 %, puis analysées par immunodétection
avec les anticorps monoclonaux anti-kératines 19, 18, 13 et
8. Sur les photos n°22
et n°23,
nous avons regroupé les résultats de la séparation des kératines
et de leur reconnaisssance par immunodétection pour les cellules
témoins (T), ce qui contribue à la caractérisation de notre
modèle, mais aussi pour les cellules traitées par l'acide rétinoïque
(A et AR), étude dont les résultats seront commentés plus loin. |
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Les bandes observées après coloration du gel au bleu de Coomassie
(photo n°22)
montre que les kératines extraites des cellules témoins (T) ont
des poids moléculaires d'environ 72 ; 67 ; 64 ; 61,5 ; 58 ; 52,5
; 51,5 et 49,5 kD. Or ce résultat est surprenant puisque la distribution
des principales cytokératines de l'épithélium trachéal ne fait apparaître
que des cytokératines dont les poids moléculaires sont compris entre
40 kD et 58 kD (Moll, 1982, tableau n°1). De même, l'anticorps anti-K19,
commercialisé pour la reconnaissance de la kératine de poids moléculaire
40 kD, permet après immunodétection de révéler la présence de 2
bandes à 67 et 52,5 kD. L'immunodétection par l'anticorps anti-K18
montre la présence de 2 bandes à 52,5 et 49,5 kD alors que nous
aurions dû obtenir au moins une bande à 45 kD. L'immunodétection
avec l'anticorps anti-K13 montre la présence de 5 bandes à 67 ;
64 ; 58 ; 52,5 et 49,5 kD tandis que l'immunodétection avec l'anticorps
anti-K8 montre une bande à 67 kD. Avec ces 2 derniers anticorps,
des bandes théoriques à respectivement 54 et 52,5 kD auraient dû
être visualisées. La bande de 67 kD est donc révélée par l'anticorps
anti-K19 mais aussi par les anticorps anti-K13 et anti-K8. De même
la bande de 52,5 kD est révélée par les anticorps anti-K19, anti-K18
et anti-K13 et la bande à 49,5 kD est révélée par les anticorps
anti-K18 et anti-K13.
Ces résultats étonnants et que nous tenterons d'expliquer plus
loin ont été obtenus par 2 fois au cours d'extractions conduites
à partir de deux populations cellulaires différentes. Parmi les
problèmes soulevés par ces résultats, notons la présence de la bande
à 67 kD qui pourrait correspondre à de l'albumine sérique : en effet
notre milieu de culture est additionné de 2 % d'Ultroser G dont
nous avons pu obtenir auprès de la société qui le commercialise,
qu'il contenait une petite fraction sérique d'environ 5 %.
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