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Les tests in vitro revêtent à l'heure actuelle une grande importance pour déterminer la biocompatibilité d'une susbstance. Ils permettent d'éliminer rapidement les substances les plus toxiques et évitent ainsi le sacrifice inutile de bon nombre d'animaux ce qui n'est pas négligeable, tant du point de vue éthique qu'économique. Les tests in vitro n'excluent pas l'expérimentation animale, mais doivent être considérés comme une première étape de discrimination avant les tests d'évaluation de la biocompatibilité in vivo. Afin de rester conforme au principe actuel d'évaluation de la cytocompatibilité : "évaluer in vitro un biomatériau ou biomatériel potentiel face au système cellulaire humain caractéristique du tissu auquel il va être confronté in vivo" (Harmand, 1986), nous avons pris comme modèle d'étude de culture, la culture de cellules épithéliales de la trachée humaine pour étudier l'effet de gaz anesthésique halogéné. Un tel modèle de culture de cellules différenciées humaine doit être, préalablement à toute expérimentation, bien défini quant aux paramètres de leur prolifération, à l'expression de leur phénotype c'est-à-dire leur capacité à synthétiser in vitro les protéines que ces cellules synthétisent in vivo.

Nous avons obtenu ces cellules en culture par la technique de sortie d'explant, à partir de prélèvements effectués lors de dons d'organe. Malgré la réussite de nombreuses sorties d'explant et la possibilité de cultiver certains d'entre eux pendant plusieurs mois (4 à 5 mois), nous n'avons pas obtenu autant de cellules que nous l'aurions souhaité. Ceci est lié à la limitation de la capacité proliférative de cellule différenciées (Hayflick, 1961) et a constitué l'étape restrictive de notre travail.

Nous avons donc dans un premier temps, étudié le phénotype des cellules obtenues in vitro et nous avons vérifié qu'il correspondait au phénotype attendu exprimé in vivo. Dès la sortie d'explant, des cellules de type épithélial respiratoire (polygonales, jointives en pavés et en monocouche) ont été distinguées d'un autre type cellulaire apparu de temps à autre dans nos cultures : des cellules d'allure fibroblastique (allongées, avec de nombreuses ramifications et en multicouche). Nous avons donc opéré une sélection pour ne conserver en sous-culture que les cellules épithéliales. Les critères morphologiques retenus (microscopie électronique) ont permis de préciser la nature épithéliale des cellules cultivées : présence de spécialisations de surface telles que les microvillosités et de desmosomes entre les cellules.

Afin de confirmer le phénotype épithélial trachéal, nous avons étudié l'expression par ces cellules des kératines 19, 18, 13 et 8 de la classification de Moll. L'expression simultanée de ces quatres kératines, est caractéristique soit d'un épithélium trachéal, soit d'un épithélium vésical (Moll, 1982), mais l'origine des prélèvements n'était pas à mettre en doute !

Nous avons comparé l'expression de ces quatre kératines dans des coupes de tissu (in vivo) et en culture cellulaire. Nous avons constaté qu'elles étaient exprimées dans les deux cas et que leur expression qualitative était comparable in vivo et in vitro. Les études réalisées sur les kératines après extraction cellulaire, séparation par électrophorèse et identification en tant que telles à l'aide d'anticorps monoclonaux, ont montré la présence de kératines de poids moléculaires compris entre 49,5 et 72 kD, alors que d'après la littérature, les poids moléculaires des kératines d'un épithélium respiratoire sont théoriquement compris entre 40 et 58 kD (Moll, 1982).

Ainsi les résultats obtenus, tant sur le gel d'électrophorèse que sur les membranes de nitrocellulose ne s'accordent pas totalement avec ceux de la littérature (Moll, 1982 ; Bordenave, 1993) et en diffèrent par 2 points essentiels : non seulement les bandes obtenues ont des poids moléculaires trop élevés par rapport à ceux attendus (cependant avec un nombre de bandes identiques ; Bordenave, 1993), mais plusieurs poids moléculaires sont reconnus par un seul et même anticorps avec en outre, des réactions croisées entre les anticorps par rapport aux protéines isolées (notamment 67 kD).

Si l'on postule que la technique d'extraction des kératines est fiable puisque depuis sa mise au point (Francke, 1978), son utilisation est souvent citée dans les publications (Domingo, 1992), la présence de protéines contaminantes comme l'albumine sérique (PM : 67 kD) est peu probable car elle est pratiquement absente du milieu de culture (tout au plus 0,004 % en concentration finale) et n'aurait aucune raison d'être reconnue par des anticorps anti-kératines

S'agissant de la spécificité des anticorps liée à la reconnaissance d'un type cellulaire, elle ne peut pas être mise en doute puisque ni les fibroblastes parfois présents dans nos cultures, ni les cellules endothéliales vasculaires n'ont été révélés par ces anticorps. De plus, le deuxième anticorps marqué à la péroxydase et utilisé pour révéler les anti-kératines n'est pas retenu de façon spécifique sur les membranes de nitrocellulose.

Tab 4 : Cliquez sur l'image pour l'agrandir

Nous nous sommes assuré auprès de la Société Boehringer qu'il pouvait exister des reconnaissances aspécifiques de certaines kératines avec les anticorps monoclonaux que nous avons utilisés (tableau n°4) : par exemple l'anti-K19 peut reconnaître outre la kératine 19, les kératines épithéliales trachéales 5, 6, 13, 14 et 15 ; le même raisonnement peut être appliqué pour l'anti-K18 et l'anti-K13. Par conséquent, il semble bien que les bandes révélées correspondent à des kératines synthétisées par les cellules mais kératines probablement très modifiées par nos conditions de culture et les hypothèses avancées pour tenter d'expliquer ces résultats pourraient inclure une modification des protéines au niveau de la séquence en acide aminés, ou une modification des protéines à type de glycosylation. Ce dernier phénomène a d'ailleurs été décrit dans la littérature (Domingo, 1992).

Une déglycosylation (par digestion enzymatique à l'aide de glycosidase) des protéines avant la migration devrait permettre d'aller plus avant. La séparation en monomères de kératines, telle que nous l'avons réalisée en conditions dénaturantes (SDS) et réductrices (b mercaptoéthanol) est peut être insuffisante puisque certains auteurs (Franke, 1983) préconisent comme dénaturant l'utilisation d'urée à la concentration de 8 à 10 M pour éviter la réassociation des monomères de kératines ; ce phénomène de formation de paire (types acide-basique) est bien connu (Sun, 1984 ; Hatzfled, 1985) particulièrement pour les kératines 8 et 18. L'observation sur la photo n°22 d'une bande aux environs de 100 kD pourrait correspondre à ce phénomène. En outre, la phosphorylation des filaments intermédiaires, bien connue in vitro (Domingo, 1992) est un facteur supplémentaire s'opposant à la dissociation des cytokératines.

Fig 22 : Cliquez sur l'image pour l'agrandir

Faute de nombreux prélèvements, nous avons maintenu les explants en culture le plus longtemps possible, ce qui nous a permis de constater au fil des repiquages un certain nombre de midifications, classées en deux groupes :

1) La coexistence de cellules épithéliales et de cellules fibroblastiques (dont la nature a été confirmée par immunomarquage avec un anticorps anti-vimentine) dont certaines (avoisinant les cellules épithéliales) sont également marquées pau un cocktail d'anticorps anti-cytokératine (AE1/AE3). Ce phénomène pourrait être rapproché de celui qualifié par certains auteurs (Benali, 1991) de transition de cellules épithéliales en cellules fibroblastoïdes.

2) La perte de l'inhibition de contact cellulaire associée à l'augmentation de l'expression de la kératine 13 et à des modifications morphologiques intracellulaires. Ces constatation correspondent probablement à ce que les auteurs décrivent, quand ils définissent le phénotype squameux (Chopra, 1989 ; Jetten, 1989a,b,c, 1992).

Le phénotype squameux, tant in vivo qu'in vitro est fortement dépendant de la présence de rétinoïdes. In vivo par exemple, tant chez l'Homme que chez les rongeurs, la déficience eb vitamine A (rétinol) et/ou les agressions toxique ou mécaniques sont responsables de la transformation de l'épithélium trachéal, qui d'un caractère pseudostratifié, évolue vers un épithélium stratifié et squameux (Wong, 1971 ; Keenan, 1983). Cette transformation est réversible en présence de rétinoïdes (Gouveia, 1982).

L'acide rétinoïque apparaît déterminant en culture pour la voie de différenciation empruntée par les cellules épithéliales trachéales (Rearick, 1989). En absence d'acide rétinoïque, les cellules se dirigeront vers une différenciation squameuse tandis qu'en présence d'acide rétinoïque, les cellules se dirigeront vers une différenciation mucosécrétoire. Nos résultats sont en accord avec ces onbservations.

Il semble que nos cellules cultivées en absence d'acide rétinoïque adoptent un phénotype squameux, objectivé par une perte de l'inhibition de contact (stratification de l'épithélium), la formation probable d'une enveloppe cornifiée (marquage membranaire intense avec l'anticorps AE1/AE3) et une augmentation de l'expression de la kératine 13. En revanche, les cellules cultivées en présence d'acide rétinoïque semblent exprimer un phénotype mucosécrétoire qui se traduit par une diminution de la prolifération, une augmentation de la sécrétion de glycoconjugués et peut-être des modifications des vésicules intracytplasmiques. Ces phénomènes ont été observés par certains auteurs (Chopra, 1989) aux mêmes concentrations d'acides rétinoïque (10^-10 à 10^-6 M) que celles que nous avons utilisées (Chopra, 1989 ; Jetten, 1992). Il semble que la présence d'acide rétinoïque soit nécessaire dans la composition du milieu de culture de cellules épithéliales. Bien que certains auteurs utilisent l'acide rétinoïque (10^-8 M) en routine dans le milieu de culture (Benali, 1991), il est difficile d'apprécier quelle doit être la concentration d'acide rétinoïque à utiliser et à quel moment doit être supplémenté la milieu de culture. Il faut pouvoir augmenter la différenciation en type mucociliaire sans pour autant inhiber trop précocément la prolifération cellulaire. La différenciation squameuse étant décrite comme réversible, nous avons opté dans ce travail pour une supplémentation en acide rétinoïque au 5^ème jour de culture, de façon à laisser les cellules se multiplier.

Concernant l'application du modèle à l'étude de gaz anesthésique, notre étude s'est limitée à l'halothane car nous n'avons pu obtenir que tardivement l'appareillage complet du circuit de gaz. De plus, le réceptacle a nécessité des perfectionnements techniques pour être adaptés à notre propos. La mise au point du protocole de contact a nécessité :

- d'adapter le débit d'air : trop important, il induit une évaporation accélérée du milieu de culture (plus de 500 µl en 6 heures) privant ainsi les cellules de substance nutritive et provoquant une réaction faussement positive de cytotoxicité,

- de mesurer de façon séquentielle la concentration en CO₂ et en halothane par l'analyseur faute de quoi l'aspiration constante de gaz dans le réceptacle (de petit volume) est responsable de l'élimination de l'halothane avant même qu'il ne soit solubilisé dans le milieu de culture, provoquant ainsi une réaction faussement négative de toxicité.

Nous avons pu détecter une altération drastique de l'activité des cellules mises en présence de 5 % d'halothane. Ces résultats, bien que différents du point de vue expérimental, rejoignent ceux obtenus par certains auteurs qui ont étudié l'effet de l'halothane sur les courants ioniques cellulaires. L'halothane (0,6 à 4 %) aurait une action inhibitrice sur les canaux Ca²⁺, Na⁺ et K⁺ des cellules musculaires lisses de la paroi coronaire canine (Buljubasic, 1992) et ceux des préparations d'épithélium trachéal canin (Pizov, 1992). Pour ces derniers auteurs, l'altération de sécrétion fluide résultante pourrait contribuer in vivo à ralentir la clairance mucociliaire dans la période périopératoire. Ce phénomène est bien connu en clinique et favorise les complications pulmonaires post-opératoires des sujets hypersécrétants.

Les seuls tests in vitro publiés ont été réalisés sur des érythrocytes humains, montrant une inhibition par l'halothane de l'activité Ca²⁺-ATPase de la membrane plasmique (Kosk-Kosicka, 1993) ainsi qu'une toxicité de l'halothane (0,3 à 0,7 %) sur des hépatocytes de rat en culture (Wodey, 1993). Les sites précis d'action de l'halothane restent encore à ce jour inconnus.

Cette méthode d'investigation de l'effet de l'halothane jusqu'alors inexplorée montre que la cytotoxicité sur les cellules épithéliales trachéales en culture n'apparait qu'à partir d'une concentration supérieure à 3 %. Cette concentration est supérieure à celle utilisée en clinique (1,5 à 2 %). Ces résultats ne sont que préliminaires et il est nécessaire de les affinier en matière de seuil de concentration d'halothane et de temps de contact. Ces expérimentations pourraient être suivies par l'étude d'autres halogénés utilisés en clinique tels que l'isoflurane ou l'enflurane. Elles pourraient être complétées par l'étude de la sécrétion de glycoconjugués afin d'appréhender in vitro une éventuelle modification des capacités sécrétoires des cellules sous l'influence des anesthésiques halogénés.

Rapports de stages
  DEA
   Introduction
   I
   II.A
   II.B
   II.C
   II.D
   II.E
   III.A
   III.B
   III.C
   III.D
   Discussion
   Bibliographie