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D - APPLICATION A L'ETUDE DES GAZ ANESTHESIQUES

D-1-CARACTERISTIQUE DU GAZ ETUDIE
D-2-DESCRIPTION DU SYSTEME EXPERIMENTAL
D-3-BANQUE DE CELLULES
D-3-1-Congélation
D-3-2-Décongélation
D-4-CONDITIONS DE CULTURE ET PROTOCOLE DE CONTACT
D-5-MESURE DE L'ACTIVITE METABOLIQUE DES CELLULES : TEST AU MTT

D-1 - CARACTERISTIQUES DU GAZ ETUDIE

Tab 2 : Cliquez sur l'image pour l'agrandir

Les agents anesthésiques par inhalation usuels sont le protoxyde d'azote (N20) et les anesthésiques halogénés. Parmi ces derniers, l'halothane est un hydrocarbure saturé dérivé de l'éthane (CH3-CH3), les atomes d'hydrogène étant substitués par des halogènes (Br, Cl, et F) (tableau n°2).

Les anesthésiques volatils halogénés sont conservés sous forme liquide et administrés sous forme de gaz (ou vapeur). La vaporisation est le passage de la forme liquide à la forme gazeuse, passage assuré par un vaporisateur interposé sur le circuit décrit ci-dessous. La solubilité de l'anesthésique est la propriété essentielle qui détermine la cinétique des anesthésiques par inhalation. Le coefficient de partage entre la phase gazeuse et un milieu liquide est en général utilisé. Il définit le volume de gaz dissous dans le solvant ou milieu biologique par rapport au volume présent dans le gaz. Ce coefficient diminue avec la température mais est indépendant de la concentration. Le coefficient sang/air de l'halothane est de 2,3. A 1 % de concentration dans l'air, la concentration est de 2,3 % dans le sang.

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D-2-DESCRIPTION DU SYSTEME EXPERIMENTAL (photos n°2 et 3)

Ph 2 : Cliquez sur l'image pour l'agrandir

Le gaz que nous avons utilisé a des caractéristiques constitutives proche de l'air expiré : azote 75 %, oxygène 20 %, gaz carbonique 5 % et provient d'une bouteille (1). Celui-ci passe dans un vaporisateur (Fluotec 3, Cyprane) (2) qui diffuse de l'halothane à une concentration prédéterminée. Le mélange air + halothane barbotte dans un bain-marie où il est chauffé et humidifié à 37°C (3), avant d'arriver dans un réceptacle (4) maintenu à 37°C par un circuit d'eau (Climacell System, Cultimat) (5), le réceptacle pouvant accueillir un boîte de culture quatre puits contenant les cellules. Le couvercle du réceptacle est équipé de deux sorties dont l'une permet d'éviter la surpression et l'autre est connectée à un analyseur (moniteur PM 8050, Dräger Medical s.a.) (6) permettant de détecter le pourcentage d'anesthésique halogéné véhiculé et la concentration de CO2. Le système est fonctionnel et adapté à l'analyseur de gaz pour un débit variant de 3 à 5 l/min.

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D-3-BANQUE DE CELLULES

Afin d'utiliser pour ces tests des populations cellulaires homogènes, nous avons constitué une banque de cellules épithéliales en réunissant des cellules issues de premier passage mais de différents repiquages pour constituer 3 lots.

D-3-1-Congélation

Après détachement des cellules par traitement à la trypsine et numération, les cellules sont centrifugées (15 min, 800 g), le surnageant est éliminé et le culot est repris dans une solution composée de 70 % de milieu de culture, 20 % de sérum de veau foetal, 10 % d'un cryoprotecteur (DMSO : diméthylsulfoxide, Sigma) puis filtrée. Les cellules sont ensuite réparties dans des tubes NUNC CRYO (2 x 10⁶ cellules/tubes) préalablement réfrigérés dans la glace. Les tubes sont ensuite placés 1 h à - 20°C, puis 16 h à - 80°C et conservés jusqu'à utilisation dans l'azote liquide (- 196°C). Nous avons ainsi congelé 9 tubes, soit 18 x 10⁶ cellules.

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D-3-2-Décongélation

Les cellules sont rapidement décongelées dans un Bain-Marie à 38°C. Afin d'éliminer le DMSO, très toxique pour les cellules (sauf à très basse température), la suspension cellulaire est diluée dans 10 volumes de milieu de culture et centrifugée (800 g, 15 min). Le culot est remis en suspension dans du milieu de culture supplémenté et les cellules sont ensemencées à densité déterminée (40000 cellules/cm²), dans des boîtes 4 puits collagénées. Le milieu de culture est renouvelé le lendemain et les cellules sont entretenues jusqu'à l'obtention de la confluence, dans l'incubateur.

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D-4-CONDITIONS DE CULTULRE ET PROTOCOLE DE CONTACT

Dans la boîte contenant les cellules confluentes, le milieu de culture est renouvelé et la boîte est placée dans le réceptacle pendant 6 heures en présence de 5 ou 3 % d'halothane, tandis qu'une boîte témoin sera incubée dans les mêmes conditions mais sans halothane (témoin air) et une autre boîte témoin restera en conditions standards dans l'incubateur. Nous avons contrôlé toutes les heures dans le réceptacle la stabilité des concentrations en anesthésique et C0₂. A l'issue du temps d'incubation, nous réalisons un test permettant d'apprécier l'activité métabolique des cellules (test au MTT).

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D-5-MESURE DE L'ACTIVITE METABOLIQUE DES CELLULES : TEST AU MTT

Ce test est basé sur la mesure de l'activité d'une enzyme mitochondriale, la succinate déshydrogénase, capable de métaboliser le sel de bromure de tétrazolium 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2, 5-diphényl tétrazolium bromide (MTT : MethylThiazol Tetrazolium (Sigma)), soluble dans l'eau en un sel insoluble le formazan. A la fin de l'incubation, le surnageant est prélevé et la couche cellulaire est rincée deux fois avec du PBS. 500 µl par puits d'une solution de DMEM (sans rouge phénol)-MTT à 5 mg/ml sont alors ajoutés pendant 3h à 37°C. Après cette période d'incubation, le MTT est enlevé et les cristaux de formazan insolubles formés sont dissous dans 600 µl de DMSO. L'absorbance est alors mesurée à 540 nm. L'intensité de la couleur bleue obtenue est directement proportionnelle à l'activité métabolique des cellules.

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Rapports de stages
  DEA
   Introduction
   I
   II.A
   II.B
   II.C
   II.D
   II.E
   III.A
   III.B
   III.C
   III.D
   Discussion
   Bibliographie