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C - ETUDE DE L'EFFET DE L'ACIDE RETINOIQUE SUR LES CELLULES EPITHELIALES

C-1-CINETIQUE DE PROLIFERATION CELLULAIRE
C-2-SECRETION DE GLYCOCONJUGUES MARQUES

Comme nous l'avons déjà dit, l'acide rétinoïque joue un rôle déterminant dans le différenciation des cellules épithéliales en culture. En absence d'acide rétinoïque, les cellules s'orientent vers d'une différenciation squameuse (Jetten, 1992). Par contre, en présence d'acide rétinoïque, les marqueurs de la différenciation squameuse sont supprimés et, il est observé entre autres, une diminution de la prolifération et augmentation de la sécrétion de glycoconjuguée (Chopra, 1989). Afin d'étudier l'effet de l'acide rétinoïque sur les cellules épithéliales de trachée humaine, nous avons donc mesuré en présence ou en absence d'acide rétinoïque :

- la cinétique de prolifération cellulaire

- la sécrétion de mucus après marquage radioactif d'un précurseur : la [³H]-glucosamine,

tandis que l'expression des kératines après extraction a été étudiée et la morphologie des cellules a été examinée en microscopie électronique à transmission.

Lors de ces études, l'acide rétinoïque (Sigma Retinoic acid (Vitamin A Acid ; Tretinoin) all ttrans) est dissous dans l'alcool absolu. Les concentrations des solutions mères utilisées sont les suivantes : 10^-4, 10^-6 et 10^-8 M. Lors des traitements des couches cellulaires, 1 % de ces solutions est ajouté au milieu. Nous obtenons ainsi des concentrations finales de 10^-6, 10^-8, 10^-10 M. Ces concentrations sont celles utilisées dans la littérrature (Chopra, 1989 ; Saunders, 1993). Les témoins sont traités par 1 % d'alcool.

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C-1-CINETIQUE DE PROLIFERATION CELLULAIRE

L'étude de la cinétique de prolifération cellulaire a été réalisée au 1^er passage en utilisant des boîtes multiples de 96 puits de 0,32 cm², stériles, en plastique de qualité culture tissulaire. Les puits sont ensemencés à une densité de 40000 cellules/cm². Les cellules sont placées dans un incubateur à C0₂ pouvant maintenir une atmosphère à 5± 0,1 % de CO₂ et une humidité relative de 98 % à 37°C. Le milieu de culture est renouvelé tous les deux jours. Quatres jours après l'ensemencement, le mileiu de culture est supplémenté avec 10^-6 M d'acide rétinoïque, le témoin étant supplémenté avec 1 % d'alcool. Le traitement est renouvelé en même temps que le milieu de culture. Les comptages sont réalisés par décollement des cellules par trypsination aux temps choisis suivants : J1, J4, J6, J8, J11, J13 après l'ensemencement. Les cellules sont comptées grâce à une cellule de Malassez.

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C-2-SECRETION DE GLYCOCONJUGUES MARQUES

L'effet de l'acide rétinoïque sur la sécrétion de mucus par les cellules épithéliales a été examiné par l'incoporation de [³H]-glucosamine dans les macromolécules sécrétées. Les cellules d'un premier passage sont ensemencées à raison de 40000 cellules/cm² dans des puits de 2 cm². Les cellules sont placées dans un incubateur à CO₂ pouvant maintenir une atmosphère à 5± 0,1 % de CO2 et un humidité relative de 98 % à 37°C. Le traitement par l'acide rétinoïque est effectué à partir du 5^e jour de culture. Le milieu de culture est supplémenté avec 10-6, 10-8, ou 10-10 M d'acide rétinoïque, le témoin étant supplémenté avec 1 % d'alcool. Après 6 jours de traitement (3 renouvellements du milieu de culture), 3 puits par concentration sont traités avec 10 µCi/ml (370 kBq/ml) de [³H]-glucosamine pendant 24 heures. Le milieu de culture est ensuite récupéré, auquel est ajouté 0,5 ml de PBS qui a servi à laver la cupule. La couche cellulaire après détachement est dénombrée. Le milieu de culture est ensuite dialysé contre 100 volumes d'eau à 4°C pendant 2 jours, le bain de dialyse étant changé 4 fois. Les échantillons sont récupérés et placés dans des tubes à scintillation contenant du liquide à scintillation (Ecoscint ATM (Prolabo) biodégradable). La radioctivité incorporée est déterminée en scintillation bêta (temps de compatage 1 minute).

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Rapports de stages
  DEA
   Introduction
   I
   II.A
   II.B
   II.C
   II.D
   II.E
   III.A
   III.B
   III.C
   III.D
   Discussion
   Bibliographie